ISRAEL ALVAREZ ZEPEDA


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1 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA DETERMINACION DE ESTRADIOL EN MASAS MUSCULARES DE BOVINOS COMO RESULTADO DEL TIPO DE SACRIFICIO EN EL RASTRO MUNICIPAL DE ZAPOPAN, JAL. TESIS PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: MEDICO VETERINARIO Y ZOOTECNISTA PRESENTA: ISRAEL ALVAREZ ZEPEDA GUADALAJARA, JALISCO, 985

2 A LA MEMORIA DE MI PADRE: Lauro Alvarez del Toro A MI MADRE: Elena Zepeda Barboza A MIS HERMANOS: Lauro Lupita Jorge Aurelio Sergio Ma. Elena Ma. de Lourdes Cesar Octavio

3 A MI ASESOR: M.V.Z. Miguel Carbajal Seria Por su gran ayuda y tiempo que me dedic6. A MI PADRINO: M.v.z. Antonio Cesar S. A Ml J:URADO: M.v.z. Octavio Rivera Mart!nez M.v.z. J. Antonio Glez. Mendoza Q.F.&. Yolanda L6pez Ill!n M.v.z. J. de Jesas Trujillo Aguirre M.v.z. Feo. Javier Medi.na Ambriz

4 Al Dr. Q.F.B. Ernesto Noriega Valencia Por su colaboraci6n en la realizaci6n del presente trabajo. Al M.v.z. Ricardo Garc!a Lozano A TODAS AQUELLAS PERSONAS: Que me ayudaron a través de mi carrera.

5 I N D I C E INTRODUCCION PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA HIPOTESIS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS PARTICULARES MATERIAL ME TODO RESULTADOS' DISCOS ION CONCLUSIONES RESUMEN REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS S S -.! lb 35

6 INTRODUCCION Las referencias más antiguas de mataderos datan de unos 2,500 años A.c., en Roma existía el oficio de carnicero desde esta época, sin embargo, no se sabe con precisi6n cuá~ do esta práctica surgi6 como actividad industrial, aunque se infiere que su inicio coincidió con la fundaci6n de las gran// des ciudades (9). ~/' Desde el comienzo de las civilizaciones antiguas lospueblos dominantes y los más progresistas se alimentaron--con carne (9), entre éstas la carne de bovino cons-tituye la base de numerosos platillos que se utilizan en la alimentaci6n hu mana ( 2 ), además de las características nutricionales -- otras propiedades especiales a saber: - Proteína 8-22% ( seg~n la naturaleza del corte y clasifi_ caci6n del animal). - Alto valor biológico ( por sus ami~oácidos esenciales y b~ lance de ellos ). - Digestibilidad, superior a la proteína de origen vegetal. La carne se considera como el alimento básico para el humano, puesto que la necesidad de proteína para un hombre - adulto es de gr/kg de peso corporal; niños lactantes gr/kg.: niños de 2 a 3 años 2.5 gr/kg., se requiere que- cuando menos el 50% de éstas deban ser cubiertas por prote!_ nas de origen animal preferentemente (2,9), sin embargo,- con las proteínas vegetales un humano puede vivir sin probl~ mas. za: A través de los años surgieron varios tipos de matan_ - Matanza kosher,-este método consiste en seccionar los gra~

7 des vasos, tantode entrada como de salida del coraz6n, por lo cual el animal sufre un eatres p~olongado, ya que a -w muerte se presenta por. choque hipov.ol mico. - Pistola de dardo, se usa en animales de difícil manejo, selogra con el disparo de un dardo con anest~sico o sedante - lo cual permite la captura del animal para facilitar el sa crificio. - Mazo, consiste en un traumatismo en la zona craneo-frontalpara lesionar masa encef~lica y provocar un estado de incon$ ciencia al animal, se utiliza fundamentalmente en equinos. - Armas de fuego, al disparar una bala que se incruste en lamasa encef~lica, provoca un estado de inconsciencia. - Bióxido de carbono, se introduce a los animales a una cároa ra de gas con una concentraci6n de 50 a 60% de bi6xid9 de - carbono, preferentemente mezclado con 30% de oxígeno que - provoca inconscientia. - Electricidad, se coloca un ele~trodo 5 cm. arx~ba de cada - ojo y se hace pasar una corriente ue 600 V., 6 amp. durante dos segundos, esto genera despolarización de las c~lulas - nerviosas. Puntilla, -, secciona a nivel del tallo cerebral a través - de la articulaci6n occipitoatlantoidea. - Pistola de émbolo oculto, el émbolo de la pistola penetraal cráneo y destruye la corteza cerebral (2). Cabe señalar que la mayoría de lo~~~étodos provocan la inconsciencia del animal antes de ser desangrado, esto desde - hace muchos años es parte de los m~todos Europeos.

8 3 Cada uno de los procesos descritos inducen a diferen_ tes grados de alarma en los animales que se sacrifican, ya - que los animales expuéstos a una serie de factores que prov~ quen "es tres" originan siempre u n aumento de secreci6n de - las hormonas adrenales, en la fase inicial de la alarme lassecreciones de las glándulas suprarrenales se activa y la s~ crecí6n queda bajo control del sistema nervioso central~elí.~ hipotálamo se estimula por el estres, e induce a 'la libera_- ci6n de corticotropina que conduce a la secreci6n de ACTH en la hip6fisis, ésta a la vez provoca la biesíntesis de este_ roides suprarrenales entre ellos los estr6genos con la ayuda del 3'5' AMP cíclico 7 3 ) ~ Los estr6genos son biol6gicamente inactivos en dosispequeñas, pero como muchas otras sustancias, pueden ocasio - nar efectos indeseables en grandes dosis. Entre los efectost6:"<icos de los estr6genos están el incremento en la reten - ci6n de agua, hemorragias uterinas, mastodinia, agravaci6n - de fibroides uterinas, mastitis quística cr6nica, migraña y el riesgo de.. tromflebitis. Con dosis grandes administradas - por períodos prolongados se puede provocar cáncer en cepas - de ratones susceptibles. En la mujer la administraci6n de a~ticonceptivos, por largo tiempo o como terapia de reemplazoen menopausia u ovariectomía no incrementa el cáncer mamario. Herbert, Unfeld~r y Poskanzor. ( 0 ), reportaron casos de ~ denocarcinoma vaginal en mujeres j6venes cuyas madres habían reci~ido terapla con estr6genos durante la preñez. La dosisaplicada se encontraba en el rango de 0. a 00 mg. por díadurante tres meses. La F.o.A., en los Estados Unidos de Norteamérica tol~ ~~.como residuo en los tejidos animales comestibles hasta una parte por bill6n de estr6genos ( pl)b ) (B) i' Eitist.en de 5,000 a 65,000 sitios receptores de las c~lulas blanco cap~

9 4 ces de reaccionar con sustancias hormonalmente activas. Cada receptor conjuga hasta cinco mol~culas. En la actualidad esposible detectar residuos estrog~nicos en los tejidos comes_ tibles de los animales muy inferiores al umbral capaz de pr~ ducir una respuesta biológica ( 8), existe evidencia de quecada receptor necesita una o dos mol~culas, por tanto se ne_ cesitan entre 5,000 y loo millones de moléculas por c~lula - para producir una respuesta fisiol6gica. En los hígados de bovinos conteniendo ilegalmente 2 - ppb. de estr6genos se encuentran 8.4 x 0 2 mol~culas. Al e~ mer hígado del animal se absorbe en intestino el 3% o sea, x 0 moléculas, cada célula recibir!a aproximadamente- 4 mol~culas de estr6genos muy inferior a las 5,000 a 00 mi_ llones necesarios para que sea una respuesta fisiológica. La dosis mínima para provocar una respuesta fisiol6gi ca por los estrógenos es de 00 microgramos x 0 7 mo= léculas. La evidencia indica que con las dosis altas de resi duos de estr6genos calculados anteriormente no existe peli_ gro en el humano. ( 8} Sin embargo Delane (8), menciona que "s6lo es necesa rio una mol~cula de estrógeno en el sitio y momento para ca~ sar un cambio en el genoma celular y producir cáncer". De a_ cuerdo a esto las cantidades ínfimas de estr6genos encontr~ dos en los tejidos animales comestibles bastarían para prov~ car cáncer.

10 5 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Para que los consumidores tengan acceso a carne de ca_ lidad es necesario que el manejo del ganado en el transportehacia los mataderos, durante su estancia en ellos y al momen_ to del sacrificio sea el adecuado, ya que'diversos estudios- \ {,2,4 ), demuestran que bajo otras circunstancias como eltransporte prolongado, cambios Slimáticos severos, inanición, ruidos, etc. se prod~cen un estado de excitaci6n general en - el animal que se conoce como "ten,si6n" (estres) (3, 5, B, 24) que tiene gran relaci6n con la calidad de la carne, debido a que se modifican los niveles químicos de iones K+, Na+, Cl-, Ca++ y o 2, co 2, así como lasconcentraciónes hormopales norma_ les del organismo especialmente de estr6genos a nivel de mús~ culo ei~riado. (6,7).

11 6 HIPOTESIS.La eoncentraci6n muscular de Estradiol var!a con el tipo de sac~ificio 4ebido a la diferencia enintensidad del estres que se produce.

12 7 OBJETIVO GENERAL Establecer las consecuencias de los dos procedimientos de sacrificio que se utilizan en la actualidad en la mayoríade los rastros, cuantificándose las concentraciones de estra_ diol retenidas en masas musculares de animales que fueron so metidos a un estres antes del sacrificio. OBJETIVOS PARTICULARES.- Determinar la concentraci6n muscular de estradiolen animales sacrificados mediante el método de puntilla y por pistola de émbolo oculto. 2.- Establecer la variaci6n de la hormona descrita enrelwc~~n con el tipo de sacrificio.

13 8 MATERIAL REACTIVOS.- Las cantidades de reactivos que se indi - can son suficientes para llevar a cabo un an!lisis completo ~or duplicado..- Cloruro. de metileno. Dos litros. Se filtra con gel de sí lice antes de usar. 2.- Cloroformo. cuatro litros. Debe de redestilarse con co 3 - K2 anhidro. 3.- Alcohol metlico absoluto. cinco litros y medio. Redestí lese con co 3 K 2 anhidro. 4.- Acetato de etilo. Un litro. Redestílese con co 3 K 2 anhidro. 5.- Tolueno. Ocho litros y medio. Redestílese con co 3 K 2 anhi_ dro. 6.- Acetona. Doscientos ml. Redestílese con co 3 K 2 anhidro. 7.-" Hexano. Quinientos inl. Redestílese con co 3 K 2 anhidro. a.- FÓrmamida. Trescientos ml. Redestílese con co 3 K 2 anhidro 9.- Alcohol etílico absoluto. Doscientos ml. 0.-Alcohol etílico de 80 (v/v) Cien ml. ll.-patr6n de estradiol. Se disuelven 25 mg. de estradiol en 25 ml. de alcohol etílico absoluto. Esta solución contie ne mg/ml.

14 9 2.- Azul de tetrazol. Se disuelven 24 mg. de colorante azulde tetrazol en 200 ml. de agua destilada. 3.- Hidr6xido de sodio 0. N Doscientos ml. 4.- Hidr6xido de sodio N. Doscientos ml. 5.- Hidr6xido de sodio 2 N. Doscientos ml. 6.- Acido acético 6 N. Quince ml. ú.- Formol al 37%. Cinco ml. 8.- Acido clorhídrico concentrado.diez ml Nitr6geno químicamente puro. Un cilindro EQUIPO;.- cámaras cromatogr!ficas. Redondas (30 de diámetro por- 60 de altura ) con accesorios para disolvente en crom~ tografta descendente; recipientes de vidrio ( de 25 cm. de diámetro por 7.5 de altura ) para la fase estacion~ ria y recipientes rect&ngulares bajos. Se requieren - dos juegos. 2.- Lámpara de luz ultravioleta. {Longitud de onda 'larga). Una. 3.- Baño de agua a 37 C. uno 4.- Placas de silica gel F. Treinta hojas de 46.3 por 56.5 ca. e 30 hojaa ).

15 0 5.- Estufa secadora a 80 C. Una CRISTALERIA: l.- Frasco de vidrio color ~mbar de 3.75 litros. Uno' 2.- Agitador mecánico. Uno 3.- Embudos de decantación 4,000 m l. - dos 3,000 m l. - dos 2,000 m l. - dos,000 m l. - dos 500 m l. - dos 200 m l. - cuatro 4.- Balones,000 m l. - dos 200 m l. - dos 00 m l. - dos 25 m l. - cuatt>g s.- Frascos Erlenmeyer con tap6n de vidrio 500 m l. - dos 250 m l. - dos 00 m l. - dos 6.- Probetas con tapón de vidrio 00 m l. - dos 50 m l. - cuatro

16 .- Probetas comunes,000 ml. - dos 8.- Micropipetas calibradas loo microlitros - dos 50 microlitros - cuatro 25 microlitros - ocho 5 microlitros - seis 4 microli tr6s - dos 2 microlitros - dos microlitro - dos

17 2 METODO: Para el presente trabajo se obtuvieron 2 muestras de m~ sas musculares de pierna provenientes de 6 bovinos sacrifica dos en el Rastro Municipal de Zapopan, Jal.; todos estos ani_ males fueron uniformados respecto a los siguientes parámetros: raza cebuina, edad entre 8 y 30 meses, machos y peso entre y 400 Kgs.; sometidos además a las condiciones más paree~ das de manejo. De estos bovinos 3 provinieron de finalizaci6n en corra_ les de engorda y fueron sacrificados por el método de pistola de émbolo oculto, el resto con orígen alimenticio en pastoreo fueron sacrificados mediante puntilla que provoca traumatismo y secci6n a nivel de tallo cerebral a través de la articula - ci6n atlante-occipital. Una vez sacrificado el anima~, eviserado, se tomaron las muestras, en seguida se trasladaron al laboratorio de análi_~ sis biom~dicos y toxicol6gcos ubicado en la calle Col6n #767 interior 207, Sector Hidalgo, Guadalajara Jalisco. Algunas etapas fueron trábajadas en el llrea de 'nvestqaci6n en el la boratoro de bioquímica de la Facultad de Medicina de la u. de G. que fueron sometidas a! siguiente estudio: - Determinac6n de estradiol, por el matodo de cromatografíaen capa~aelg'ada. *I"JJ) *La descrpc6n de.!a t~cnica se encuentra en el ap~ndice al unal del t:ral5"&jo.

18 3 RESULTADOS LOs dos grupos presentaron valores de estradiol por en_ cima de los normales descritos por los investigadores Co_- rreia A.A., Graca F. Da ( 2) ( gdfica ). El grupo de animales sacrificados,por el m&todo de pun_ tilla present6 valores de estradiol muy cercanos a los norma les ( cuadro No. y gráfica ). LOs animales correspondientes al grupo sacrificado conel ~6todo de pistola de 6mbolo oculto se encontr6 los valo_ res duplicados a los descritos normales ( cuadro No.2 y grá_ fica )

19 4 CUADRO No. l. valores DE ESTRADIOL EN MASAS MUSCULARES PRO~ NIENTES DE TRES BOVINOS SACRIFICADOS POR EL ~ TODO DE PUNTILLA. MUESTRAS CANTIDAD EN ''pt/tr A 8 At a, 22 e 8 e, 9 CUADRO No. 2.- VALORES DE ESTRADIOL EN MASAS MUSCULARES PROVE NIENTES DE TRES BOVINOS SACRIFICADOS POR EL ME TODO DE PISTOLA DE EMBOLO OCULTO. MUESTRAS CANTIDAD EN pc /gr o 28 o, 30 E 28 E, 27 F 3 2 F, 30 NCYI'A: Las muestras representadas con la misma letra provienen de la mis ma, únicamente trabajadas por separado para verificar la exactitud de la técnica, obteniendo un margen de error de O a 2 pg/g.

20 5 GRAFICA; :- VALORES DE ESTRADIOL EN MASAS MUSCULARES DE BOVINOS CO!<!PARANDO DOS TIPOS DE SACRIFICIO CON EL NORMAL Animales sacrificados con pistola de ~mbolo Animales sacrificados con puntilla oculto Valores normales descritos por los investigadores Correia A.A., Graca F. Da. ( 7

21 6 DISCOS ION La t~cnica de cromatografía en capa delgada permiti6 d~ tectar estradiol en concentraciones inferiores a los 20 pg/g de carne. Este método de determinación de estradiol es sen~! llo y r&pido pero con el 6nico inconveniente que los reacti vos necesarios son costosos. Los investigadores Correia, A.A., Graca F. Da. (7) en- sus trabajos realizados en el año 979 determinaron las can tidades de estradiol encontrando 4.4 pg/g de carne los cua les fueron considerados como normales. Los resultados obten! dos en el presente trabajo están por encima de los descritos como normales. Las concentraciones de estradiol detectadas en las mues tras provenientes del grupo sacrificado con pistola de robo lo oculto fueron superiores a las encontradas en aquellas - provenientes de los animales sacrificados por el método de - puntilla, con esto se infiere que el primer grupo de anima - les estuvo expuesto a un estres mayor.

22 7 CONCLUSIONES Para la deterrninaci6n de estradiol es factibl~tilizarla técnica de crornatograf!a en capa delgada por su sencillezy prontitud que se puede obtener los resultados y adem~s el - margen de error tan reducido que ofrece O a 2 pg/g de carne - ( cuadros y 2 ). El margen de error puede atribuirse tam - bién que la muestra tornada tuviese mayor o menor cantidad degrasa entre las fibras musculares, conociendo el origen lipo~ de del estradiol, éste se fijar4 a las grasas principalmente. ( S, 0 ) Las cantidades de estradiol en masas musculares variarán con la cantidad de estres provocado antes del sacrificio, los animales sacrificados por el método de pistola de émbolo ocu~ to presentaron concentraciones mayores de estradiol a los en_ centrados en el grupo de animales sacrificados por el m~todode puntilla, por lo que se deduce que el método de puntilla - es más adecuado. Las variaciones en las concentraciones de estradiol en - tre los dos grupos estudiados es alto, por esta raz6n pudiera existir otros factores que alteraron los valores de estradio~ para esto deber!a continuarse con la investigaci6n. Los valores de estradiol encontrados en los dos grupos - están por encima de los valores normales (7) esto sugiere se adop~en tipos -de manejo y matanza menos estresantes. El presente trabajo permitir~ en un futuro desarrollar - la t~cnica de cromatografía en capa delgada dentro de la F. M. v.z. de la u. de G. De esta manera poder reducir costos- en posteriores trabajos.

23 8 RESUMEN Con el objeto de establecer las consecuencias de los prq cedimientos de sacrificio que se utilizan en la actualidad,- en la mayor!a de los rastros, en el presente trabajo se estu_ di6 los niveles de estradiol retenidas en masas musculares ( pierna ) determinadas por el m~todo de cromatografía en ca_ pa delgada, a dos grupos de bovinos sacrificados por pistola de ~rnbolo oculto y por puntilla. Cada tipo de sacrificio induce a diferentes grados de a_ larma en los animales; los animales expuestos a una serie defactores que provoquen "estres" originan siempre un aumento--. de secreción de las hormonas adrenales, en la fase inicial de la alarma las secreciones de las gl~ndulas suprarrenales se - activa y la secreci6n queda bajo control del sistema nervioso central. El hipotálamo se estimula por el estres, e induce a la liberación de corticotropina que conduce a la secreción de ACTH en la hipófisis, sta a la vez provoca la biosíntesis de esteroides suprarrenales. (7). Los valores de estradiol obtenidos en el grupo de anima les sacrificados con puntilla fueron poco superiores a los - descritos como normales por los investigadores Correia A.A., Graca F.Da. ( 4.4 pg/g de carne ) en cambio los resultados e~ centrados en el grupo de animales sacrificados por el métodode pistola de f~bolo oculto fueron duplicadas las cantidades.

24 9 APENO ICE Determinaci6n de estradiol: El estradiol y otros esteroides cárnicos se someten a - hidr6lisis ácida y después se extraen con cloruro de metile_ no. El estradiol se separa de los otros esteroides mediantetres fraccionamientos cromatográficos. El primer sistema cr~ matográfico separa el estradiol y otros esteroides "c 2 " del material extraño existente en el extracto de cloruro de met~ leno. El segundo sistema cromatográfico separa el estradioldel cortiso y sus derivados. El tercer sistema cromatográfl co aisla el estradiol y permite su determinaci6n semicuanti_ tativa, comparando la florescencia del estradiol en el ter_ cer cromatog~ama con la fluorescencia de patrones de estra - aó. PROCEDIMIENTO: Se recoge un gramo de maéerado de carne en un frasco de 3.75 litros de boca ancha y de color marr6n, al cual se agr~ garon previamente 5 ml. de ácido ac~tico 6 N y 5 ml. de fo~ mol.se ajusta el ph de la carne a.0-.5 con el HCL concen_ trado. con el objeto de que se lleve a cabo la hidr6li$is de - los asteroides conjugados, se deja la muestra en reposo 24 - horas a temperatura ambiente. Se mide el volumen de la carne en una probeta graduada Y se separan dos porciones de 000 ml. cada una para el aná_ lisis. ( Todas las determinaciones se hacen por duplicado. - Cada porci6ri se pasa a un embudo de decantación de 2000 ml.

25 20 Se agregan a cada embudo de decantaci6n 50 ml. de clor~ ro de metileno y se mezcla por rotaci6n durante un minuto. Se deja en reposo 0 minutos para que se separen las fases, sepasa después la capa inferior de cloruro de metileno a un ero_ budo de decantaci6n de 000 ml. y se desecha el residuo cárn! co. Siguiendo la misma t~cnica ciones de 50 ml. de cloruro de metileno. se extrae la carne con 3 por_ Se reúnen los extractos de cloruro de metileno en el em budo de decantaci6n de 000 ml. y se desecha el residuo cárn! co. Los extractos mezclados de cloruro de metileno se lavancon 60 ml. de NaOH 0. N fría, y se aspira la soluci6n de NaOH sobrenadante a un embudo de decantaci6n de 500 m. De manera similar, se lavan los extractos mezclados decloruro de metileno con 3 porciones de 60 ml. de agua destil~ da. Los líquidos de lavado acuoso se aspiran al embudo de de cantaci6n a 500 ml. Se procede ahora a extraer la mezcla de NaOH con los lí quidos de lavado acuosos, empleando 60 ml. de cloruro de meti leno. El ext: ~cto de cloruro de metileno obtenido se agrega a la mezcla de extractos de cloruro de metileno obtenidos pre_ viamente y se desecha el residuo acuoso. Se filtra el extracto de cloruro de metileno con un pa_ pel de filtro previamente lavado con disolvente, en un bal6nde 000 ml. Se coloca el bal6n en baño de agua 37 C y se eva pora el contenido mediante corriente de nitr6geno, hasta un - volumen de 5 ml. aproxim~damente.

26 2 Se transfiere el residuo de la evaporaci6n, junto con - dos lavados con 5 ml. de cloruro de metileno y dos lavados - con 5 ml. de alcohol et!lico absoluto, a un bal6n de 25 ml. Se evapora a sequedad el contenido de este bal6n en unbaño de agua a 37 C, mediante una corriente de nitr6geno. PRIMER FRACCIONAMIENTO CROMATOGRAFICO a) Preparaci6n de la c~mara cromatogr~fica. Se recubre el interior de la cámara con una doble capade píacas silica gel F. En un embudó de decantaci6n de 3000 ml. se colocan 800 ml. de cloroformo, 200 ml. de hexano, 00 ml. de formamida y loo ml. de agua destilada. Se mezcla enérgicamente varios m! nutos y se deja en reposo otros 0 minutos para que se sepa_ ren las fases. Se pasan unos 200 ml. de la capa inferior de hexano y cloroformo a un Erlenmeyer con tap6n de vidrio, y se guardan para su uso posterior. El resto de la capa inferior de hexano y cloroformo sevierte por el papel de filtro que recubre la c~mara cromato gráfica. Se tapa ~sta herm6ticamente y se deja en reposo to tal por lo menos dos d!as. b) cromatografía. Placas silica gel F. Mediante micropipetas se aplican 25 microlitros de lassoluciones patrones de cortisona y estradiol en las l!neas - de partida de cada canal lateral de la hoja cromatográfica.

27 22 Se colocan 00 microlitros de una mezcla :: de cloro formo, acetato de etilo y alcohol metílico en el ba6n de 25 ml." que contiene el residuo de asteroides, procediendo a sudisoluci6n por rotaci6n suave. Con una micropipeta se aplica cuantitativamente la soluci6ri así obtenida, al cromatograma, haciendo una angosta banda a lo largo de la línea de partida. Se pasan porciones de 50 microlitros de la mezcla de..,- cloroformo, acetato de etilo y alcohol metílico al bal6n, p~ ra disolver esteroides residuales, y se aplican despu~s a la línea de partida del cromatograma. Generalmente hasta porciones para la transferencia cuantitativa de los esteroi des. Se colocan el cromatograma en la cámara cromatográfica, llenando inmediatamente el recipiente de disolvente con la- mezcla de hexano y cloroformo saturada con formamida y agua, que había sido reservada tal como se indicara en a, "Prepar~ ci6n del recipiente cromatográfico". Se deja llevar a cabola migraci6n cromatográfica duran~e 3 horas. Se retira el cromatograma de la cámara cromatográfica, y se suspende de una varilla de vidrio mediante broches. Senecesitan unos 0 minutos para que se evaporen los disolven tes. Se corta..:uidadosamente el canal central del cromatogr~ ma, reservándolo paré!. la eluci6n de los esteroides. Las por_ ciones remanentes se depositan sobre una lámina de vidrio. Se colocan 5 ml. de la soluci6n de azul de tetrazol en una probeta de 50 ml. con tap6n de vidrio y se diluye 30 ml. con NaOS 2N; se vierte cuidadosamente en seguida esta solu - ci6n alcalina sobre el cromatograma, para que los canales la

28 terales queden uniformemente saturados con el colorante. Así aparecen inmediatamente las manchas azules correspondientesa la cortisona ( compuesto E) y al estradiol ( compuesto F ) se procede entonces a medir las distancias a que ha migradocada componente desde las líneas de partida. Se deja secar - después el cromatograma a temperatura ambiente. Del canal central del primer cromatograma secorta unfragmento del cromatograma que comprenda desde unos 5 cm. por debajo del centro de la mancha "F", hasta 7. 5 por debajo..: del centro de la mancha "E". Se pliega y se coloca en un frasco de 00 ml. con tap6n de vidrio. Se agregan 30 ml. dealcohol etílico de 80 y se agita suavemente con un agitadormecánico durante una hora, decantando después el alcohol etí lico en un embudo de decantación de 200 ml. Se pasan 60 ml. de cloruro de metileno al frasco con ta p6n de vidrio que contiene todavía el fragmento del cromato_ grama, se agita 5 minutos y se decanta el cloruro de metile no al embudo de decantación de 200 ml. Se repite una vez más este proceso de extracci6n con 60 ml. de cloruro de metileno los cuales tambi~n se pasan el ambudo de decantación. Se ag! ta el embudo de decantación de 200 ml. durante un minuto, y se deja en reposo 0 minutos para que se separen las fases. Se filtra despu~s la capa inferior de cloruro de metileno - con papel de filtro (previamente lavado con disolvente), pa_ sándola a un bal6n de 200 ml. Se extrae la fase alcohólica - que queda en el embudo de decantaci6n, con 0 ml. de cloruro de metileno. Este extracto de cloruro de metileno se filtraal balón. Se coloca el bal6n en un baño de agua a 37 C y seevapora el contenido mediante corriente de nitrógeno, hastareducir el volumen a unos 5 ml. Este residuo se transfiere, junto con dos lavados de 5 ml. cada uno de cloruro de metil~ no y dos porciones de alcohol etílico absoluto, a otrc balón

29 24 de 25 ml. Se evapora el contenido a sequedad a 37 C, mediante ce_ rrip.nte de nitr6geno. Si quedan huellas de formamida, habráque calentar al vac!o por un breve período, a 50 a 55 C. Es_ te calentamiento deberá ser lo más corto posible. SEGUNDO FRACCIONAMIENTO CROMATOGRAFICO: a) Preparaci6n de la cámara cromatográfica. Se recubre la cámara cromatográfica con una doble capade placas silica gel F. En un embudo de decantaci6n de 4000 ml. se colocan 2000 ml. de tolueno, 400 ml. de alcohol metílico y 600 ml. de - agua destilada. Se mezcla enérgicamente varios minutos y sedeja en reposo 0 minutos para que se separen las fases. Se transfieren unos 500 ml.. de la capa inferior de alcohol metílico a un Erlenmeyer con tap6n de vidrio y se re - servan para su utilización posterior. El resto de la capa de alcohol metílico se coloca en un recipiente redondo para museo, el cual se deposita n el fo~ do de la cámara cromatográfica. se transfieren unos 200 ml. de la capa s _,}Jrenadante de tolueno a un Erlenmeyer con tap6n de vidrio y se reservan para su utilización posterior. El resto de la capa de tolueno se vierte cuidadosamente sobre el papel ~e filtro que recubre la cámara cromatográfi ca, la cual se cierra después herméticamente, dejándola asfpor lo menos dos días.

30 25 b).- Cromatografía.- Se pasan unos 25 ml. de la capa estacionaria de alcohol metílico a una cápsula baja y cuadrada y se sumerge la hojade papel en la fase alcoh6lica cuidando de que se impregne ~ niformemente y se suspende después con broches de una vari - lla de vidrio. La fase se evapora parcialmente en unos 0 mi nutos. Mediante micropipetas se aplican 25 microlitros de lospatrones de cortisona y estradiol en la línea de partida decada canal lateral de la hoja cromatográfica. Se colocan 00 microlitros de la mezcla de cloroformo, acetato de etilo y alcohol metílico (::), en el balón de- 25 ml. que contiene el residuo de esteroides, y se hace ro - tar cuidadosamente el bal6n para que el residuo se disuelvaen el disolvente. Mediante una micropipeta se aplica cuanti_ tativamente esta soluci6n de esteroides en la línea de part! da del segundo cromatograma, empleando la misma técnica indi cada para el primer cromatograma. Se coloca el cromatograma en la cámara cromatográfica y se deja equilibr~r durante 30 minutos. Se llena despu~s el recipiente del solvente con tolueno (fase m6vil) y se deja llevar a cabo la migraci6n cromatogr! fica durante 7 horas. Se seca el cromatograma, se corta el canal central y se colorean los canales laterales con tetrazol, tal como se des cribi6 para el primer cromatograma. Se corta un fragmento de papel de filtro del canal central que vaya desde 2.5 cm. por debajo del centro de la mancha "F" hasta 2.5 cm. por debajo-

31 26 del centro de la mancha"e", y se coloca en un frasco de 00 ml. con tap6n de vidrio. Se pasan 30 ml. de alcohol etílico absoluto al frascocon tapón de vidrio y se agita suavemente con un agitador m~ c5nico durante una hora. Después se decanta el alcohol et! co a un balón de 00 ml. Se repite esta elución de los este roides con otra porción de 30 ml. de alcohol etílico absolu_ to, que se reúne despu s con la primera en el balón de 00 - m l. Se procede a evaporar el contenido del balón hasta 5 - ml. en baño de agua a 37 C y en corriente de nitrógeno; se - transfiere el residuo, con lavados repetidos de alcohol etí lico, a otro balón de 25 ml. y finalmente se evapora el con tenido de éste a sequedad. TERCER FRACCIONAMIENTO CROMATOGRAFICO a) Preparación de la cámara cromatográfica Se recubre el recipiente cromatográfico con una doblecapa de placas de silico gel F, tal como se ha descrito ante riormente. En un e:~udo de decantación de 4000 ml. se colocan 000 ml. de agua destilada, 000 ml. de alcohol metílico absoluto, 800 ml. de tolueno y 200 ml. de acetato de etilo. Se mezclay se dejan separar las fases tal como se indicó para el segu~ do fraccionamiento. Se transfieren unos 500 ml. de la capa inferior de al_ cohol metílico a un Erlenmeyer con tapón de vidrio y se re --

32 27 servan para su utilizaci6n posterior. El resto de la fase dealcohol metílico se pasa a un frasco redondo para museo, quese deposita en el fondo de la cámara cromatográfica. Se pasan unos 200 ml. de la fase sobrenadante de tolueno y acetato de etilo a un Erlenmeyer con tap6n de vidrio y se - conservan para su utilizaci6n posterior. Se vierte el remane~ te de la fase sobrenadan te de tolueno y aceta-to de etilo so_ bre el papel de filtro que reéubre el interior de la cámara - cromatográfica, se cierra ~sta herméticamente y se la deja en reposo por lo menos dos días. b) Cromatografía.- Se corte una hoja de plaéa.. silica _gel F. de acuerdo conlas dimensiones señaladas en la figura. Utilizando micropipetas, se aplican 25 microlitros de las dos soluciones patr6n al cromatograma, tal como indica la figura. LOs dos patrones son útiles como localizadores para - la coloraci6n con tetrazol. En los puntos marcados., 2, 4 y 5- F, se aplican, respectivamente.,2,4 y 5 microgramos de com puesto F, que servirán como patrones para comparar la fluores cencia. Se colocan 80 microlitros de la mezcla de cloroformo, a_ eetato de etilo y alcohol met!lico (zlzl: O en e.l bal~j.l ~~e - contiene el residuo de esteroides, y se hace rotar cuidadosa_ mente el bal6n hasta que se completa la disoluci6n. Com micr~ pipetas, se aplican 5,25 y 50 microlitros del extracto de,...:~ teroides en los puntos del cromatograma marcados "/6 A.-,--- '5/6 A", respectivamente. Es necesario actuar con rapidez pa ra evitar las p'rdidas de extracto de esteroidea, por evapor~ ci6n.... Estos puntos corresponden a /6, 5/6, y 0/6, aprox! ~- -~ ' -

33 CD N ~ 5".., [~~~~ L. ( rigen l:r! o o o o L.inea e suspensión Sac:cl6n E" leludlda,.- t-+ o ---- o ---- o; ~ o IL sión ; Sacción etudid L../ 7'h"_~ 25 lfu, 2 ~In. 4 0 / 5 25 EFFIIFAFAFEF " i i b, a boboóo o!.. : o o Ll,... ~...-nsl6n Origen ''F'' "E"

34 29 rnadamentc, del volumen total de 80 microlitros. Se coloca el cromatograma en la cámara cromatográfica y se deja equilibrar durante 60 minutos. Se llena el recipiente de solvente con la fase m6vil det~lueno y acetato de etilo, y se deja llevar a cabo la migra ción cromatográfica durante 5 horas. Se seca el cromatograma a temperatura ambiente. Se colocan 50 ml. de soluci6n de tetrazol en una probeta de 00 ml. con tap6n de vidrio y se diluye hasta loo rol. con NaOH N. Se vierte en seguida la soluci6n alcalina de tetrazol en un :c~ipiente cuadrado y bajo. Se une la parte superior del papel cromatográfico media~ te broches a una varilla de vidrio, y se sumerge cuidadosame~ te en la soluci6n de tetrazol impregándolo uniformemente. Se suspende el cromatograma en la estufa a 80 C, durante unos 6 minutos, hasta que el papel justo acabe de secarse. Se observa inmediatamente el cromatograma con luz ultra violeta para la valoraci6n de los puntos fluorescentes amari llos. Mediante comparaci6n con los puntos del patr6n "F", secalcula semicuantitativamente el estradiol en las alícuotas - /6, 5/6 y 0/6, y se deduce así el contenido total de es tradiol por gramo de carne. Para hacer la determinaci6n cuantitativa del estradiol - se hizo un raspado de la mancha formada en el cromatograma, -

35 30 disolvi.6ndosc en cloruro de met~leno, se centrifugo, se de_ canto y se hizo un barrido en un espectrofot6metro UV-240 de la marca SHIMADZU. Testigo.- Patr6n.- 2 ml. cloruro de met~leno. 0 pg. de estradiol diluido en 2 ml. de cloruro de met~leno. Problema.- Aforado a 2 ml. Cálculo: D. o. Muestra X concentraci6n del patr6n pg./g. o.o. Patr6n

36 t... '- :-+- i - ~! -.. -t J- : f.. <-,_ -! '.3 ~ - t:-) :;.,.. c,- _~ ~~., L- l-- -i.,. --.-:~--~--- -L r t - ' --,. ' --!-,... ~- - ' y!... J. ;T r '--: -: ~. -t--- -!--- \~: _.-~-~f. ~.:;.....,

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40 35 REFEl{ENClAS BI J3Ll OGRAFICAS.- ALUJA A.S., Berruecos J.M Problemas de aprovi sionamiento de carne en el D.F. y su trascendencia al bienestar humano. Rev. Vet. M~xico. ~ Pp ALUJA A.S Necropsias en animales domésticos: - Métodos de eutanasia, CECSA. Héxico, P ANDRADE D.S.J Patología especial de los anima les domésticos. 2da. edicí6n; Endocrinología. Intera mericana. México. P BAREHAM J.R The concept of stress. Vet. Rec. - 2_. Pp BHAGAVAN N.V Bioquímica. Interamericana S.A. México. 6.- CERVENKA J Influencia of 9attle transportation under a highep climatic temperatura of meat valve after slaughter. Act. Vet. Br. 38 Pp CORREIA A.A. Díaz, Graca F. Da Ante-mortem stress in slaughther animals and the probable abnormal meat composition resulting frorn various biochemical mediatora. In proceedings. Budapest, Hungary. P COUNCIL on agricultura! science and technology vete rinary and human toxicology P FISHER P., Bender A Valor nutritivo de los Ali mentos. Limusa, M6xico.

41 LF:HNINGER A.L Bioquímica: Aspectos bioquímicos de la acci6n hormonal. omega, S.A. España. P LEVINSON Samuel A Diagnóstico Clínico de Labo ratorio. El Ateneo, Argentina. 2.- NIINIVAARA P.F. Antila P valor nutritivo de la ~ Acribia. España. 3.- THORNTON H. 97. Relación entre el estres fisiol6gi_ co y la calidad de la carne. Rev. Vet. M~xico 3 P. 29-3

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